无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒影响骨髓间充质干细胞的增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (16): 2526-2531.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.011

• 纳米生物材料 nanobiomaterials • 上一篇下一篇

无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒影响骨髓间充质干细胞的增殖

陈鹏¹，张杰¹，荣冬明¹，韩忠宇²，袁思捷¹，田京¹

¹南方医科大学珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282；²南方医科大学第二临床医学院，广东省广州市 510515

修回日期:2014-02-01 出版日期:2014-04-16 发布日期:2014-04-16
通讯作者: 田京，教授，副主任医师，硕士生导师，南方医科大学珠江医院骨科中心，广东省广州市 510282
作者简介:陈鹏，男，1987年生，山东省济宁市人，汉族，南方医科大学珠江医院在读硕士，主要从事关节骨病与骨质疏松研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2011B031800147)

Effects of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

Chen Peng¹, Zhang Jie¹, Rong Dong-ming¹, Han Zhong-yu², Yuan Si-jie¹, Tian Jing¹

¹Department of Orthopaedics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China; ²the Second Clinical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Revised:2014-02-01 Online:2014-04-16 Published:2014-04-16
Contact: Tian Jing, Professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
About author:Chen Peng, Studying for master’s degree, Department of Orthopaedics, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Science and Technology Plan Projects, No. 2011B031800147

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前关于无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞增殖活性的影响及毒性效应的研究较少。

目的：探究无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对大鼠骨髓间充质干细胞的毒性、增殖等生物学活性的影响。

方法：制备含0，25，50，75，100 mg/L无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒的培养液，采用5种质量浓度的培养液培养大鼠骨髓间充质干细胞，24 h后进行普鲁士蓝染色验证超顺磁性氧化铁纳米标记情况，CCK-8法检测细胞增殖，同时检测细胞上清液中乳酸脱氢酶活性及细胞内超氧化物歧化酶活性。

结果与结论：普鲁士蓝染色证实，50 mg/L及以上质量浓度的无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒均可100%标记细胞，但25 mg/L组尚无法达到完全标记。随着质量浓度的增高，无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞的抑制率及毒性逐渐增大，25 mg/L无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞的影响最小，50 mg/L无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒虽然对细胞生长的影响较25 mg/L组为高，但二者在统计学上无明显差别(P > 0.05)。结果表明，50 mg/L无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对骨髓间充质干细胞标记率高，且细胞毒性及对细胞增殖活性的影响较小。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

关键词: 生物材料, 纳米材料, 无葡聚糖包被的, 超顺磁性纳米颗粒, 骨髓间充质干细胞, 乳酸脱氢酶, 超氧化物歧化酶, 增殖活性, 细胞毒性, 普鲁士蓝染色, 标记率

Abstract:

BACKGROUND: Currently, the research about effect of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles on cell proliferation and cytotoxicity is relatively much less.

OBJECTIVE: To evaluate the effects of 0, 25, 50, 75, 100 mg/L non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles on the proliferation and cytotoxicity of rat bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Culture media containing 0, 25, 50, 75, 100 mg/L non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles were prepared for culture of bone marrow mesenchymal stem cells. After 24 hours of culture, the cells were confirmed using Prussian blue staining, and cell counting was detected using cell counting kit-8. Meanwhile, lactate dehydrogenase activity in the supernatant and intracellular superoxide dismutase activity were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: Loading of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles in BMSCs was confirmed by Prussian blue staining. The percentage of cells labeled with non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles was up to 100% when the cells were incubated with a non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticle solution of 50 mg/L and above, but 25 mg/L was insufficient to label all of the cells. Furthermore, as the concentration of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles decreased, the cell proliferation rate decreased gradually. The 25 mg/L group had a minimum cell proliferation rate, but the 25 and 50 mg/L groups showed no statistically significant difference (P > 0.05). Therefore, 50 mg/L is considered as the appropriate concentration of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles, under which, the labeling efficiency is higher and the cytotoxicity is lower.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: biocompatible materials, magnetite nanoparticles, stem cells, cell proliferation, lactate dehydrogenases

中图分类号:

R318

陈鹏，张杰，荣冬明，韩忠宇，袁思捷，田京. 无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒影响骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(16): 2526-2531.

Chen Peng, Zhang Jie, Rong Dong-ming, Han Zhong-yu, Yuan Si-jie, Tian Jing. Effects of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(16): 2526-2531.

图/表（结果） 3

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定 与中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所合作成功研制出生物性能稳定的、尺寸可控的、单分散的超顺磁性氧化铁纳米颗粒^[11]，表面经修饰后其可在生理细胞培养液中保持稳定，颗粒直径约12 nm(图1A)。该颗粒有很强的饱和磁矩，在低温下(6 K)有磁滞，但在室温下表现超顺磁性。采用全骨髓培养法培养法获得第3代的大鼠骨髓间充质干细胞，细胞形态为长梭形及多角形，呈漩涡状排列(图1B)。流失细胞检测结果表明该细胞高表达CD29(99.44%)及CD90(96.40%) (图2)。标记细胞行普鲁士蓝染色后，可见细胞内超顺磁性氧化铁纳米颗粒被染为蓝色，散在分布于细胞核周围(图1C)。实验中观察到，50 mg/L及以上浓度的超顺磁性氧化铁纳米颗粒培养基孵育的细胞，超顺磁性氧化铁纳米颗粒的标记率基本可达100%。25 mg/L组超顺磁性氧化铁纳米颗粒培养基孵育的细胞仍有少量未被染色，说明其未与超顺磁性氧化铁纳米颗粒充分结合。
2.2 CCK-8法测定不同质量浓度无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞增殖活性 在将无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞用于体内实验之前，需寻找到一个合适的浓度，在这个浓度下，骨髓间充质干细胞既能获得最大的标记率又不会影响其增殖及分化。CCK-8实验计算各质量浓度超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞生长的抑制率，将其绘制成柱状图(图3)，结果显示：随着超顺磁性氧化铁纳米颗粒质量浓度的增高，样本吸光度值逐渐减小，超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞对细胞的抑制率逐渐增大，25 mg/L组对细胞的抑制率最小，50 mg/L组虽然对细胞生长的抑制率较25 mg/L组为高，但二者在统计学上无明显差别(P=0.076)；25 mg/L组对细胞的标记率尚无法达到100%，而50 mg/L组可对细胞100%标记。

2.3 无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对骨髓间充质干细胞氧化损伤的影响

乳酸脱氢酶活力检测结果：25，50，75，100 mg/L无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒组乳酸脱氢酶释放率高于阴性对照组(P < 0.001)，且4组之间乳酸脱氢酶释放率随无葡聚糖包被顺磁性氧化铁纳米颗粒质量浓度升高而增加，但25 mg/L组和50 mg/L组之间比较差异无显著性意义(P=0.110)，其余组间两两比较均有显著性意义(P < 0.001)，见表1。

超氧化物歧化酶活性检测结果：随标记无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒质量浓度的增加，细胞内超氧化物歧化酶的活性逐渐降低，细胞内超氧化物歧化酶的活性与无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒的存在剂量效应，但25 mg/L和50 mg/L组之间比较差异无显著性意义(P=0.126)，其余组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.001)，见表1。

参考文献

[1] Ouyang HW,Cao T,Zou XH,et al.Mesenchymal stem cell sheets revitalize nonviable dense grafts: implications for repair of large-bone and tendon defects. Transplantation. 2006;82(2):170-174.
[2] He X,Chen Y,Wang K,et al.Selective separation of proteins with pH-dependent magnetic nanoadsorbents. Nanotechnology.2007;18:365604.
[3] Buyukhatipoglu K,Jo W,Sun W,et al.The role of printing parameters and scaffold biopolymer properties in the efficacy of a new hybrid nano-bioprinting system. Biofabrication. 2009; 1(3):035003.
[4] Leem G,Zhang S,Jamison AC,et al.Light-induced covalent immobilization of monolayers of magnetic nanoparticles on hydrogen-terminated silicon.ACS Appl Mater Interfaces.2010; 2(10):2789-2796.
[5] Kanczler JM,Sura HS,Magnay J,et al.Controlled differentiation of human bone marrow stromal cells using magnetic nanoparticle technology.Tissue Eng Part A.2010; 16(10):3241-3250.
[6] Huang DM,Hsiao JK,Chen YC,et al.The promotion of human mesenchymal stem cell proliferation by superparamagnetic iron oxide nanoparticles.Biomaterials. 2009;30(22):3645-3651.
[7] Lellouche JP,Periman N,Joseph A,et al.New magnetically responsive polydicarbazole magnetite nanoparticles.Chem Commun.2004;(5):560-561.
[8] 梁文英,莫润阳,郑敏.SPIO磁性标记细胞技术研究进展[J].青海师范大学学报:自然科学版,2010,26(1):21-24.
[9] Rath SN,Nooeaid P,Arkudas A,et al.Adipose- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells display different osteogenic differentiation patterns in 3D bioactive glass-based scaffolds.J Tissue Eng Regen Med.2013. doi: 10.1002/term.1849.
[10] Zeng G,Wang G,Guan F,et al.Human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles: the effect on neuron-like differentiation in vitro.Mol Cell Biochem.2011; 357(1-2): 331-341.
[11] Jiang J,Gu HW,Shao H,et al.Bifunctional Fe3O4–Ag Heterodimer Nanoparticles for Two-Photon Fluorescence Imaging and Magnetic Manipulation.Adv Mater.2008;20(23):4403-4407.
[12] Yan SG,Zhang J,Tu Q,et al.Transcription factor and bone marrow stromal cells in osseointegration of dental implants.Eur Cell Mater.2013;26:263-270; discussion 270-271.
[13] Li M,Li S,Yu L,et al.Bone mesenchymal stem cells contributed to the neointimal formation after arterial injury.PLoS One.2013;8(12):e82743. doi: 10.1371/journal.pone.0082743.
[14] Ritfeld GJ,Rauck BM,Novosat TL,et al.The effect of a polyurethane-based reverse thermal gel on bone marrow stromal cell transplant survival and spinal cord repair. Biomaterials. 2014;35(6):1924-1931.
[15] Zheng L,Chu J,Shi Y,et al.Bone marrow-derived stem cells ameliorate hepatic fibrosis by down-regulating interleukin-17.Cell Biosci.2013;3(1):46.
[16] Hauger O,Frost EE,vanHeeswijk R,et al.MR evaluation of the glo-merular homing ofmagnetically labeled mesenchymal stem cells in a ratmodel ofnephropathy.Radiology.2006; 238(1):200-210.
[17] Sun S,Chen G,Xu M,et al.Differentiation and migration of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted through the spleen in rats with portal hypertension.PLoS One. 2013;8(12):e83523.
[18] Wu W,Chen B,Cheng J,et al.Biocompatibility of Fe3O4/DNR magnetic nanoparticles in the treatment of hematologic malignancies.Int J Nanomedicine.2010;5:1079-1084.
[19] Wang J,Chen Y,Chen B,et al.Pharmacokinetic parameters and tissue distribution of magnetic Fe3O4 nanoparticles in mice.Int J Nanomedicine.2010;21:861-866.
[20] Daldrup-Link HE,Rudelius M,Oostendorp RAJ,et al.Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology.2003;228(3):760-767.
[21] Arbab AS,Yocum GT,Kalish H,et al.Efficient magnetic cell labeling with protamine surface complexed to ferumoxides for cellular MRI.Blood.2004;104(4):1217-1223.
[22] Bulte JW,Douglas T,Witwer B,et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells.Nat Biotechnol.2001;19(11):1141-1147.
[23] Sosnovik DE,Nahrendorf M,Weissleder R.Magnetic nanoparticles for MR imaging: agents, techniques and cardiovascular applications. Basic Res Cardiol. 2008; 103(2): 122-130.
[24] Barrett T,Kobayashi H,Brechbiel M,et al.Macromolecular MRI contrast agents for imaging tumor angiogenesis.Eur J Radiol. 2006;60(3):353-366.
[25] 唐大宗,夏黎明.对比剂的发展史[J].放射学实践,2007, 22(6): 631-633.
[26] van Buul GM,Farrell E,Kops N,et al.Ferumoxides protamine sulfate is more effective than ferucarbotran for cell labeling: implications for clinically applicable cell tracking using MRI.Contrast Media Mol Imaging. 2009;4(5):230-236．
[27] Jing XH,Yang L,Duan XJ,et al.In vivo MR imaging tracking of magnetic iron oxide nanoparticle labeled, engineered, autologous bone marrow mesenchymal stem cells following intra-articular injection.J Bone Spine.2008;75:432-438．
[28] Wang Y,Wang Y,Wang L,et al. Preparation and evaluation of magnetic nanoparticles for cell labeling.J Nanosci Nanotechnol. 2011;11(5):3749-3756.
[29] Yuan F,Dong P,Wang X,et al.Toxicological effects of cigarette smoke on Ana-1 macrophages in vitro.Exp Toxicol Pathol. 2013;65(7-8):1011-1018.
[30] El-Bahr SM.Curcumin regulates gene expression of insulin like growth factor, B-cell CLL/lymphoma 2 and antioxidant enzymes in streptozotocin induced diabetic rats. BMC Complement Altern Med.2013;13(1):368.

引言

间充质干细胞分化来源于中胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中，属骨髓中含量最高，具有强大的自我更新和增殖能力，以及多向分化潜能。该细胞因具有易获取、易分离、易培养且免疫排斥反应低，易在宿主体内长期存活，易于外源基因转染等优点，已被广泛应用于当今医学研究中，尤其是骨髓间充质干细胞移植已成为骨科疾病研究中的热点^[1]。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒是指具有磁响应性的纳米级粒子，其直径一般小于30 nm，当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超磁性状态。它比细胞、病毒、蛋白质、基因等的大小更小或者接近，这样有利于其之间发生相互作用，生物分子也容易覆盖在其表面。在外加磁场的作用下颗粒被吸引到特定组织，并在组织中聚集而发生效应，当治疗结束后撤去磁场时，颗粒将会被机体所清除。超顺磁性氧化铁纳米颗粒是一种新型磁共振细胞内对比剂，因其同时具有高热稳定性、低毒性、超顺磁性和纳米特性，并可包被不同生物大分子，已被越来越广泛地应用于生物科学研究中，包括靶向给药、肿瘤磁过热疗法、生物传感器及特异靶点的浓度示踪等。超顺磁性纳米颗粒的磁性遵从库仑定律，能够通过外加磁场来控制^[2]。这种“远距离作用”与磁场对人体组织的固有穿透性相结合，发挥出超顺磁性纳米颗粒的靶向作用，可开展磁性标记生物体的运输、固定等多方面的应用。Buyukhatipoglu 等^[3]提出磁性纳米颗粒在磁场中的反应速度取决于其直径的大小，当磁性纳米颗粒的大小低于某个临界值时处于最佳状态，此临界值主要依赖于材料自身的特性。典型的超顺磁性纳米颗粒直径为10-20 nm，纳米微粒为单磁畴，在阻断温度以下它们呈现超顺磁性^[4]。这种超顺磁性纳米微粒具有较大的磁矩常量，可忽略剩磁和矫顽力，能够像大的顺磁性原子一样对应用磁场做出快速响应。

Kanczler等^[5]运用远程磁场激活附着在人骨髓间充质干细胞的磁性纳米颗粒这个机械敏感性受体，发现它可以激活骨祖细胞体外分化，显著增加骨髓基质细胞蛋白聚糖与Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的合成及细胞外基质的产生。Huang 等^[6]发现铁羧葡胺，一种离子型超顺磁性氧化铁，在实验条件下能促进人骨髓间充质干细胞生长。这种促进作用可能与此种超顺磁性氧化铁的过氧化物样活性及消除细胞内过氧化氢的能力有关。另外，铁羧葡胺还能加快间充质干细胞的细胞周期进程，这可能与溶菌酶降解所释放的自由铁及铁对细胞周期调节蛋白表达的选择作用有关。目前合成生物相容性磁性纳米颗粒的方法有很多，但最常用的合成生物相容Fe₃O₄磁性纳米颗粒的方法为共沉淀法，即将铁的盐溶液按1∶2(或2∶3)物质的量比混合后，沉淀剂为过量的氨水或NaOH等溶液，在恒定温度和pH下，高速搅拌后离心得到沉淀，再将沉淀洗涤、干燥，即配制成超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒。采用共沉淀法制备生物相容的纳米颗粒，方法简单，操作方便。但须严格控制影响微粒粒径和磁学性能的因素，提高微粒的磁性及稳定性^[7]。目前常见的超顺磁性氧化铁纳米颗粒多为葡聚糖包裹氧化铁颗粒核心而得，颗粒直径较大，从十几到几千不等^[8]，而针对于无葡聚糖包被的、直径较小的超顺磁性氧化铁纳米颗粒研究较少。

随着超顺磁性氧化铁纳米颗粒和骨髓间充质干细胞的研究不断深入，二者的关系逐渐成为科研的焦点。然而目前国内外尚无进行无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒与骨髓间充质干细胞相结合并进行相关安全性检测的实验。实验系统探讨无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对骨髓间充质干细胞活力及增殖能力的影响，深化超顺磁性氧化铁纳米颗粒对骨髓间充质干细胞的相关作用效应，为其在再生医学及组织工程中的发展提供新线索，开辟新途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：分组对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年3至9月在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：2-4周龄SPF级Wistar大鼠，雌雄不拘，体质量90-120 g。购自南方医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK粤2006-0015。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定^[9]：取2-4周龄Wistar大鼠1只，3.5%水合氯醛麻醉，固定于鼠板上后置于紫外灯下照射0.5 h，随后将大鼠放于超净工作台上，双下肢手术部位用碘酒、乙醇消毒后，切开皮肤，钝性分离肌肉，无菌分离出两侧股骨和胫骨。剪去股骨及胫骨两端，暴露骨髓腔，操作过程中一定保持无菌。随后用注射器吸养基，按照1×10⁹L^-1的细胞浓度接种在25 cm²培养瓶中，放入CO₂细胞培养箱中孵育。48 h后去除未贴壁的细胞，并更换新鲜培养液，以后每3 d换液1次。当细胞达90%以上融合后进行消化传代，以此种方法扩增培养得到第4代骨髓间充质干细胞。收集约5×10⁵个细胞用流式细胞仪检测细胞表面标志CD35、CD44、CD45及CD90以鉴定干细胞种类及纯度。

无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记骨髓间充质干细胞：将无葡聚糖包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒溶液用0.22 μm无菌过滤器过滤除菌后，加入到含体积分数10%胎牛血清的新鲜DMEM/F12细胞培养基中，振荡混匀60 min。加入培养液并将超顺磁性氧化铁纳米颗粒的最终质量浓度分别调整为0，25，50，75，100 mg/L。取第4代大鼠骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化后吹散，收集洗涤细胞2次，吹打成单细胞悬液，以每孔5×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到2块24孔培养板中，每孔加入培养基1 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h。孵育24 h后吸弃培养液，实验组加入1 mL含超顺磁性氧化铁纳米颗粒的培养液，阴性对照组加入不含超顺磁性氧化铁纳米颗粒的培养液，空白对照组中无骨髓间充质干细胞也不加入超顺磁性氧化铁纳米颗粒。24 h后行普鲁士蓝染色，吸出培养液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，随后将多聚甲醛吸弃后用蒸馏水洗3遍，将预先配置好的2%盐酸水溶液和2%亚铁氰化钾水溶液等量混合，加入培养板中染色过夜。用蒸馏水洗3遍，梯度乙醇脱水，光镜下观察细胞染色情况并拍照。

无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞增殖活性检测：将5种不同质量浓度无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度至2×10⁷L^-1，外加无细胞的空白对照组，按每孔100 μL接种于2块96孔板中，每组每天3个复孔。培养24 h后第1天测量组每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板放入细胞培养箱中继续培养2 h，酶标仪450 nm波长读板，获得标本的吸光度值(A值)。连续培养6 d，每天的相同时间重复以上操作^[10]。根据公式：细胞抑制率=(A_实验组-A_{阴性对照组})/(A_实验组-A_{空白对照组})×100%，计算各质量浓度超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞的抑制率。

骨髓间充质干细胞内生化指标的测定：不同质量浓度无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞培养24 h后，收集上清液，按照乳酸脱氢酶试剂盒使用说明检测5组细胞上清液中乳酸脱氢酶活性；按照超氧化物歧化酶测试盒操作指南，用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶的活性。

主要观察指标：无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记前后骨髓间充质干细胞的增殖活性。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。多组间定量数据采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，检验水平α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

讨论

骨髓间充质干细胞是具有很强自我更新能力及多项分化潜能的原始细胞，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌肉细胞等，经过几次传代后仍能保持其生长特性和多向分化潜能，在组织工程和细胞治疗中具有广阔的应用前景^[12]。骨髓间充质干细胞在组织工程、临床应用的研究中已取得了很大进展。大量研究表明当组织发生损伤后，移植入体内的骨髓间充质干细胞会定向归巢至损伤区域^[13]。现有的研究资料表明，骨髓间充质干细胞取材容易，体外扩增力强。骨髓间充质干细胞作为成体干细胞主要存在于骨髓组织中，其具有贴壁生长的特性，通过全骨髓贴壁分离的方法，通过多次传代，严格控制胰酶作用时间等方法可获得比较纯的骨髓间充质干细胞^[14]。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒是目前常用的干细胞标记物，在医学领域应用广泛，其应用的基本原则是生物安全性及生物相容性，所以其毒性问题不容忽视，而这些特性是由其尺寸和表征所决定的^[15]。铁为人体正常代谢需要的元素，但过量聚积则容易引起毒性。研究显示超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记后的细胞传至第10代仍生长良好^[16]，超顺磁性氧化铁纳米颗粒具有生物可降解性，在活体内被红细胞溶酶体转化为体内铁(Fe²⁺或Fe³⁺)，最终进入正常血浆铁池，参与血红蛋白或其他代谢过程，对细胞或组织器官无明显不良反应^[17]。此外，超顺磁性氧化铁纳米颗粒已被证实在用于药物载体及肿瘤靶向治疗中具有良好的生物相容性及安全性^[18-19]。但目前使用较多的是葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒颗粒，关于无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒细胞毒性效应的研究较少。实验通过体外实验初步探讨无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒颗粒的细胞毒性，为其体内应用的安全性提供依据。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒的表面活性剂种类繁多，常见的有多聚赖氨酸^[20]、硫酸鱼精蛋白^[21]、繁枝体等^[22]，而葡聚糖作为表面活性剂的优点有：①葡聚糖分子带正电荷，能与带负电荷的Fe₃O₄产生静电吸附。②葡聚糖是一种完全由α-D-吡喃葡萄糖单体组成的多糖，其侧链由(1，4)和(1，6)连接的葡聚糖残基构成，每5个葡聚糖残基组成的重复单元有1个分支，位于主链葡聚糖残基的6-O位上，可与Fe产生共价键结合，能保持超顺磁性氧化铁纳米颗粒磁流体的稳定性^[23]。③葡聚糖结构中还包含有大量的“-OH”基团，能与一些生物大分子的氨基形成Schiff 键，产生共价键紧密连接，为超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为载体，将短链氨基酸、多肽、小分子蛋白质等靶向转运进入细胞内创造条件^[24-25]。但传统的葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒，如AMI225、AMI2227、AMI2121和SHU555A等用于干细胞标记亦存在缺陷：①均需先与鱼精蛋白或多聚赖氨酸等转染剂混合，使超顺磁性氧化铁纳米颗粒表面由负电荷变为正电荷，才能高效率转染标记干细胞，操作不便，甚至影响结果的稳定性。②在体内降解时间短，目前文献报道最长的示踪时间为12周^[26-27]，难以满足软骨修复示踪的时间要求。近年来越来越多的研究运用超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记骨髓间充质干细胞，其纳米颗粒大多都有葡聚糖包被，颗粒直径较大。而目前国内外尚无无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒的相关实验，实验首次提出将无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒与骨髓间充质干细胞相结合，研究其对骨髓间充质干细胞活力及增殖能力的影响。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒的细胞毒性及其对细胞增殖活性的影响在一定程度上决定了超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记的应用前景。Wang 等^[28]将氧化铁纳米粒子与间充质干细胞结合，MTT实验及流式细胞仪的分析结果都表明，氧化铁纳米粒子标记过程不会造成明显的细胞凋亡。实验采用CCK-8法、乳酸脱氢酶释放率及超氧化物歧化酶值探讨无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒质量浓度对骨髓间充质干细胞活性及增殖的影响。CCK-8法采用标准试剂盒和酶联免疫检测仪检测细胞线粒体内脱氢酶还原后形成的黄色的结晶物甲瓒，细胞增殖越多，该物质形成越多、显色越深，根据两者的线性关系可反映无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对细胞增殖的影响。乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，主要在于机体所有组织细胞的胞质内，一般不会向细胞外分泌，但是当细胞膜的完整性受到破坏时，胞浆内的乳酸脱氢酶会溢出，因此测定上清液中的乳酸脱氢酶活性可以很好地反映细胞膜受损伤的程度，与细胞死亡数目成正比^[29]。超氧化物歧化酶的主要功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧，产生的超氧阴离子自由基是生物体内正常的代谢产物。但是自由基的积累将使细胞膜的脂质发生过氧化作用而引起膜裂变，导致细胞损伤甚至死亡。超氧化物歧化酶可清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受伤害^[30]。因此超氧化物歧化酶值可反映细胞抵抗氧化损伤的能力。实验正是通过上述指标从宏观到微观，全方位评估了无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对骨髓间充质干细胞产生的影响。

实验结果说明随着超顺磁性氧化铁纳米颗粒质量浓度的减小，吸光度值逐渐增大，其对细胞的抑制率逐渐减小。50 mg/L组与25 mg/L组对细胞生长的抑制率在统计学上无明显差别(P=0.076)，而且细胞上清液中乳酸脱氢酶活性及细胞内超氧化物歧化酶活性检测结果也得出了同样的结论。然而，25 mg/L组对细胞的标记率尚无法达到100%。所以作者认为，50 mg/L为超顺磁性氧化铁纳米颗粒的理想标记浓度，此浓度下干细胞标记率高，且纳米颗粒的细胞毒性及其对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响较小。

由于实验条件的限制，未就无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒对其他种系干细胞的影响做进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

文章快阅

延伸阅读

超顺磁性氧化铁纳米颗粒的表面活性剂种类繁多，常见的有多聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白、繁枝体等，而葡聚糖作为表面活性剂的优点有：①葡聚糖分子带正电荷，能与带负电荷的Fe₃O₄产生静电吸附。②葡聚糖是一种完全由α- D- 吡喃葡萄糖单体组成的多糖，其侧链由（1，4）和（1，6）连接的葡聚糖残基构成，每5个葡聚糖残基组成的重复单元有1个分支，位于主链葡聚糖残基的6- O位上，可与Fe产生共价键结合，能保持超顺磁性氧化铁纳米颗粒磁流体的稳定性。③葡聚糖结构中还包含有大量的“- OH”基团，能与一些生物大分子的氨基形成Schiff 键，产生共价键紧密连接，为超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为载体，将短链氨基酸、多肽、小分子蛋白质等靶向转运进入细胞内创造条件。但是传统的葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒，如AMI225、AMI2227、AMI2121和SHU555A等用于干细胞标记亦存在缺陷:①均需先与鱼精蛋白或多聚赖氨酸等转染剂混合，使超顺磁性氧化铁纳米颗粒表面由负电荷变为正电荷，才能高效率转染标记干细胞，操作不便，甚至影响结果的稳定性。②在体降解时间短，目前文献报道最长的示踪时间为12 周，难以满足软骨修复示踪的时间要求。近年来越来越多的研究运用超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记骨髓间充质干细胞，其纳米颗粒大多都有葡聚糖包被，颗粒直径较大。而目前国内外尚无无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒的相关实验，实验首次提出将无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒与骨髓间充质干细胞相结合，研究其对骨髓间充质干细胞活力及增殖能力的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

无葡聚糖包被超顺磁性氧化铁纳米颗粒影响骨髓间充质干细胞的增殖

Effects of non-dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[2]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[3]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[4]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[5]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[6]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[7]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[8]	陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.
[9]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[10]	姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.
[11]	孙建威, 杨新明, 张瑛. 孟鲁司特联合骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3962-3969.
[12]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[13]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[14]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[15]	何林, 吴稀, 何淞, 杨森. 经聚多巴胺涂层的羟基磷灰石生物陶瓷具有亲水性与细胞黏附性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3540-3544.